Genetiniai tyrimai hematologijoje(1)

Genetikos pradininku laikomas G. Mendelis, kuris 1865 m. pirmasis suformulavo paveldėjimo dėsnius. G. Mendelis tai nustatė kryžmindamas skirtingas žirnių rūšis. Tai jam padėjo pastebėti, kad paveldėjimo požymiai yra perduodami iš kartos į kartą. Deja, tais laikais jo darbai liko neįvertinti ir buvo pripažinti tik praėjus daugeliui metų po jo mirties.

Reklama

Visgi „tikrąja“ genetikos mokslo pradžios data yra laikoma 1953 m., kai J. Watson`as ir F. Crick`as pirmieji aprašė DNR (deoksiribonukleorūgšties) spiralės struktūrą. Per pastaruosius 50 metų genetika sparčiai tobulėjo. Jau 2003 m. buvo paskelbtas visiškai išanalizuotas žmogaus genomo variantas. Šiuo metu atsiranda nauja genetikos mokslo šaka – genomika, kuri tiria ne atskirus genus, bet iškart visą genomą. Galima teigti, kad su kiekvienais metais genetika vis tobulėja, atrandama kas nors naujo, tačiau tuo pat metu iškyla ir vis daugiau klausimų.

Genetiniai tyrimai hematologijoje yra santykinai nauja sritis, tačiau jau daug pažengusi ir suteikusi nemažai informacijos apie genetinius pokyčius, jų diagnozavimą, gydymo parinkimą, ligos prognozę hematologijoje. Genetiniai tyrimai gali būti atliekami įvairiuose lygmenyse – pradedant nuo stambiausių genetinių objektų, chromosomų, baigiant smulkiausiais genetiniais objektais – genais ir jų fragmentais. Onkohematologijoje genetiniai tyrimai visų pirmą yra labai svarbūs diagnozės metu. Tam tikri genetiniai pokyčiai (specifiniai chromosomų pakitimai, tam tikrų genų mutacijos) yra specifiniai tam tikrai hematologinei ligai ir leidžia ją tiksliai ir greitai nustatyti bei patvirtinti. Tikslus genetinių tyrimų pritaikymas diagnozės metu leidžia nedelsiant parinkti gydymą būdingai ligai. Ne ką mažiau svarbūs genetiniai tyrimai yra parenkant gydymą. Pavyzdžiui, ūminės leukemijos atveju nustačius vieno tipo chromosomų pokytį yra parenkamas agresyvus gydymas, tačiau nustačius visai kitą chromosomų pokytį – gydymas parenkamas ne toks agresyvus. Tokiu būdu, atsižvelgiant į genetinių tyrimų rezultatus, ne tik optimizuojamas gydymo būdas, tačiau ir išvengiama šalutinių poveikių dėl įvairių vaistų kombinacijų.

Genetiniai tyrimai taip pat yra labai naudingi jau ligos eigoje. Jų dėka pasirenkant biologinį žymenį galima stebėti ligos eigą, jos progresiją arba pagerėjimą. Atsižvelgiant į genetinių tyrimų rezultatus ligos eigoje, galima greitai ir efektyviai keisti gydymo būdą, taip dar labiau priartėjant prie ligos sutramdymo.

Genetiniai tyrimai yra neatsiejami ne tik klinikiniuose tyrimuose, bet ir moksliniuose. Jų metu yra bandoma identifikuoti naujus genetinius pokyčius, kurie padėtų onkohematologinių ligų diagnostikoje, prognostikoje.

Šiuo metu Hematologijos, onkologijos ir transfuziologijos Molekulinės medicinos laboratorija atlieka mokslinius tyrimus, kurių metu yra atliekama ūminės limfoleukemijos pacientų kopuliacinė analizė. Surinkus visų Lietuvos ūminės limfoleukemijos pacientų mėginius, yra analizuojami jų genomai lyginamąja genomine hibridizacija (žr. toliau). Šio projekto metu bus nustatytas bendras lietuvių ūminės limfoleukemijos populiacijos genetinių pokyčių vaizdas. Tai padės individualizuoti, pagerinti diagnostiką bei gydymą konkrečiai pagal lietuvių populiaciją.

Genetinių tyrimų sritis, analizuojanti chromosomų pokyčius, vadinama citogenetika. Žinia, chromosoma yra viena DNR molekulė, turinti savo specifinę formą. Žmogus turi 46 chromosomas, tačiau kiekviena iš jų yra tam tikros formos ir struktūros. Visose 46 chromosomose yra užkoduotas visas žmogaus genomas. Visų 46 chromosomų rinkinys vadinamas kariotipu. Citogenetika tiek hematologijoje, tiek kitose medicinos disciplinose naudoja specialių dažymų sistemą, kurių dėka chromosomos yra nudažomos specialiais dažais. Jie padeda vizualizuoti chromosomas, atskirti jas bei pateikti analizei jų esamą struktūrą.

Kariotipo analizė G dažymo metodu – tai populiariausias citogenetikos analizės metodas hematologijoje. Jo metu chromosomos nusidažo juodos baltos spalvos ruoželiais, taip išryškinant jų struktūrą. Šio tyrimo metu yra nustatomi chromosomų struktūros pokyčiai, atsiradę hematologinių ligų metu. Yra nustatomi chromosomų fragmentų praradimai (delecijos), fragmentų padvigubėjimai (duplikacijos), fragmentų apsikeitimai vietomis (translokacijos). Hematologijoje ypač svarbūs yra translokacijų nustatymai. Ūminių leukemijų atveju tam tikros translokacijos gali lemti gerą ligos prognozę (translokacija tarp 8 ir 21 chromosomos), blogą prognozę (translokacija tarp 6 ir 9 chromosomų). Ši citogenetinė informacija prisideda prie klinikinių duomenų ir padeda tiksliau parinkti gydymą, profilaktikos priemones.

1 paveikslas. Citogenetinis tyrimas. Paveiksle matomas paciento, sergančio lėtine mieloleukemija, kariotipas nustatytas G dažymo metodu. Kariotipe matome visas žmogaus 46 chromosomas (23 poros). Chromosomos yra nudažytos specialiais dažais, kurie leidžia atskirti chromosomas tarpusavyje ir matyti atsiradusius genetinius pažeidimus. Rodyklėmis yra nurodyti chromosomų pakitimai. Rodyklės ties 9-a ir 22-a chromosoma nurodo translokaciją (atskilusių chromosomų fragmentų apsikeitimą tarpusavyje), vadinamą Filadelfine chromosoma. Šis genetinis pokytis yra pagrindinis genetinio tyrimo rodiklis, leidžiantis diagnozuoti hematologinę ligą – lėtinę mieloleukemiją. Rodyklės ties 2-a, 10-a ir 17-a chromosoma rodo įvykusias delecijas (atitrūkę chromosomų galai). Šie papildomai nustatyti genetiniai pokyčiai šalia Filadelfinės chromosomos leidžia priskirti pacientą blogos prognozės grupei ir galimai ligos progresijai.

Molekulinė citogenetika – genetinių tyrimų sritis, kur chromosomų pokyčiai yra tiriami pasitelkiant molekulinius „įrankius“. Plačiausiai hematologijoje yra naudojamas fluorescencinės in situ hibridizacijos (FISH) metodas. Šio genetinio tyrimo metu yra sukuriamas specialus DNR fragmentas, pažymėtas fluorescuojančiais dažais. Naudojant specialias chemines reakcijas, šį fragmentą galima „prikabinti“ bet kurioje chromosomos vietoje. Jeigu ši specifinė chromosomos vieta yra nepažeista, tuomet fragmentas geba ten prisijungti. Tačiau esant chromosomos fragmento praradimui, fluorescuojantis fragmentas neprisijungs. Tokiu būdu pasitelkus mikroskopą galima identifikuoti šiuos specifinius fluorescuojančius fragmentus. Dažniausiai yra sukuriami fragmentai toms chromosomų vietoms, kuriose yra lokalizuoti tam tikrų ligų genai. Pavyzdžiui, lėtinės limfoleukemijos ligos prognozei yra svarbus p53 genas. Esant jo delecijai, yra stebima šios ligos progresija. FISH metodas padeda greitai ir tiksliai identifikuoti šio geno būklę.

2 paveikslas. Molekulinės citogenetikos tyrimas. Pacientui, sergančiam onkohematologine liga – lėtine limfoleukemija, yra atliktas FISH tyrimas (fluorescencinė in situ hibridizacija). Šio tyrimo metu paciento kraujo mėginyje jo chromosomos yra nudažomos mėlynais fluorescuojančiais dažais (žr. paveiksle). Kitos spalvos fluorescuojančiais dažais yra pažymimi genai, atsakingi už šią ligą. Paciento atveju raudonai yra pažymėtas labai svarbus onkogenas p53. Šis onkogenas yra pagrindinis „sargas“ nuo daugelio onkologinių ligų. Žinia, visi žmonės turi po dvi kopijas visų genų, tad sveikas žmogus turėtų turėti du p53 genus. Iš šio tyrimo matome, jog raudona fluorescuojanti žymė yra tik viena – reiškia, jog pacientas turi tik vieną veikiantį genas, o kitas yra prarastas (balta rodyklė). Tokiu atveju pacientui su lėtine limfoleukemija yra nustatoma bloga prognozė. Paveiksle matome ir dvi žalias fluorescuojančias žymes – tai kontroliniai signalai, naudojami kiekvieno FISH metodo metu. Jie parodo, jog eksperimentas yra tinkamai įvykęs.

Molekulinė genetika – genetinių tyrimų sritis, tirianti atskirus genomo struktūrinius vienetus nukleotidus ar jų fragmentus. Kai kurių hematologinių ligų diagnostikai ar prognostikai yra tikslinga nustatyti ne atskirų chromosomų pokyčius, o pavienių nukleotidų pakitimus – mutacijas. Verta priminti, jog nukleotidai koduoja aminorūgštis, o iš šių yra sudaryti baltymai – pagrindinė mūsų organizmo sudedamoji dalis. Įvykus mutacijai, nukleotidai nebekoduoja tam tikros aminorūgšties arba koduoja kitą, klaidingą. Tai gali būti ligos priežastis. Ne išimtis ir hematologinės ligos. Mutacijos dažniausiai nustatomos sekoskaitos metodu. Šiuo metodu, naudojant fluorescencijos principą, galima „nuskaityti“ bet kurios genomo dalies nukleotidus. Hematologijoje dažniausiai yra nuskaitomi specifinių ligų genų nukleotidai, taip ieškant mutacijų. Pavyzdžiui ūminės mieloleukemijos atveju sekoskaita analizuojami ligai svarbūs CEBPA, c-KIT genai.

Genominiai tyrimai – tai tyrimų sritis, analizuojanti ne atskiras chromosomas, genus ar nukleotidus, tačiau visą genomą. Lyginamoji genominė hibridizacija – vienas moderniausių metodų, galintis vienu metu „parodyti“ paciento viso genomo vaizdą. Šio metodo metu fluorescenciniais dažais yra pažymimi tiek paciento genomas, tiek sveiko žmogaus genomas. Vėliau yra vykdoma šių genomų hibridizacija (sugretinimas). Jeigu pacientu genomas yra „sveikas“, be pokyčių, tuomet jis identiškai susigretina su sveiko žmogaus genomu. Tačiau jeigu paciento genome yra pokyčių (delecijų, duplikacijų), tuomet tose vietose genomai nesusigretins ir bus matomas fluorescencijos švytėjimo skirtumas. Šiuos skirtumus užfiksuoja galingi skaneriai su lazeriniais analizatoriais. Lyginamosios genominės hibridizacijos metodu galima nustatyti tiek smulkius, tiek stambius viso genomo pokyčius. Nustačius pokyčius, galima identifikuoti genus, kurie yra galimai pažeisti ir svarbūs hematologinei ligai. Šiuo metu pats naujausias ir moderniausias genominis tyrimas tiek hematologijoje, tiek kitose disciplinose yra naujos kartos sekoskaita (angl. next generation sequencing). Šį metodą galima pavadinti įprastos sekoskaitos ir lyginamosios genominės hibridizacijos mišiniu. Jo metu, hibridizavus paciento ir sveiko žmogaus genomus, galima stebėti neatitikimus vieno nukleotido tikslumu. Deja, šio metodo kaina dar šiuo metu yra prieinama tik nedidelei daliai pasaulio ir Europos laboratorijų.

Šiandien tikslingas genetinių tyrimų parinkimas ar jų derinimas labai padeda diagnozuoti hematologines ligas, tai padaro tiksliai ir greitai. Ligos eigoje šie tyrimai padeda stebėti, ar vyksta ligos progresija bei ar pasiteisina gydymas. Šiuo metu genetiniai tyrimai nuolat tobulėja, taip suteikdami daugiau vilties tiek gydytojams hematologams, tiek pacientams.

3 paveikslas. Genominis tyrimas. Pacientui, sergančiam onkohematologine liga mieloma, yra atliktas lyginamosios genominės hibridizacijos metodas. Jo metu yra sugretinama (hibridizuojama) paciento ir sveiko žmogaus genomo DNR. Specialia analizavimo technika yra stebima, ar sugretinimo metu išryškėja kokie skirtumai, kurie yra nulemiami paciento ligos pažeisto genomo. Jeigu paciento genomas yra „švarus“, be genetinių pokyčių, tuomet sugretinus su sveiko žmogaus genomu, neišryškės jokie neatitikimai. Tačiau jeigu pacientas turi genomo pakitimų, tai ties tais pakitimais nebevyksta susigretinimas ir matomas pokytis. Paveiksle matome išanalizuotą paciento 1-ąją chromosomą. Kairėje pusėje matome šios chromosomos schematinį vaizdą, o dešinėje - tyrimo rezultatą. Sugretinę paciento ir sveiko žmogaus genomų DNR matome, jog pirmoje chromosomoje yra neatitikimas – yra įvykęs dalies chromosomos fragmento praradimas (raudona žymė ir juodas iškilimas). Sudėtingos analizavimo programos „nupiešia“ virtualų kariotipą ir tiksliai nurodo, kur kiekvienoje chromosomoje yra atsiradę genetinių pokyčių